組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

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實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
(R)-(-)-1,2-Propanediol3-乙炔 97%鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.2000mol/L(0.2N)

(S)-(+)-1,2-Propanediol炔酸乙酯 99%鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.1000mol/L(0.1N)

Guar gum2-乙炔噻吩 97%鹽酸溶液 6mol/L(6N)

Xanthan gum3-乙炔苯胺 98%鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液 1000μ/ml

6-Azauridine*基硅乙酸乙酯 97%鐵標(biāo)準(zhǔn)溶液 100μ/ml

Piperazine乙氧基乙炔,己烷溶液 40 wt%己烷溶液標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.05000mol/L (0.1N)

8-Hydroxyquinaldine4-乙炔基吡啶鹽酸鹽 97%鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液 1000mg/L，溶劑：1%硝酸

Hydantoin2-乙炔苯 98%鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液 100μg/ml

Lalin4-氟苯酸 99%硝標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.005000mol/L(0.01N)（）

Kieselguhr三氟甲磺鎵 98%硝酸鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液 0.01000mol/L(0.01M)

Celite 5451-庚炔 97%鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液 1000μg/ml

Acrylyl chloride1-己炔-3- 96%鎳標(biāo)準(zhǔn)溶液 100μg/ml

Diethyl malonate6-羥基喹啉 98%氯化溶液 3.3mol/L(3.3N)

Diacetone alcohol氫化奎寧定 96%氯化溶液 3mol/L(3N)

MMA氫化奎寧 95%重鉻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1/24mol/L(0.25N)

GMA1,6-庚二炔 91%重鉻酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1/60mol/L(0.1N)

4-羧基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基自由基(>97.0%(GC)(T))Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)IL-6  白介素6抗體

4-(2-氯乙酰氨基)-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基(>96.0%(HPLC))Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjugate)IL-6  白介素6

4-基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基自由基(>95.0%(T))Tri-Methyl-Histone H3 (Lys27) (C36B11) Rabbit mAb (PE Conjugate)IL-6  白介素6

16-DOXYL-硬脂酸自由基(>95.0%(HPLC)(T))Phospho-Tuberin/TSC2 (Ser664) (D3B9Z) Rabbit mAbIL5RA/CD125  白介素-5受體α鏈抗體IL-5Rα

4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基自由基(>98.0%(GC))Pan-Cadherin (28E12) Rabbit mAbIL-5  白細(xì)胞介素5抗體

4-羥基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基苯甲酸鹽自由基(>97.0%(GC))Pan-Cadherin (28E12) Rabbit mAbIL-4R/CD124  白細(xì)胞介素4受體抗體IL-4Rα

4-異硫酰基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基自由基(>97.0%(GC)(T))Phospho-Stat3 (Tyr705) (D3A7) XP® Rabbit mAb (Sepharose® Bead Conjugate)IL-4I1  白細(xì)胞介素4誘導(dǎo)蛋白1抗體

4-(2-代乙酰氨基)-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基自由基(>98.0%(HPLC))Phospho-CASC5 (Thr943/Thr1155) (D8D4N) Rabbit mAbIL-4 (human)  白介素4抗體(人)

4-甲氧基-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧基自由基(>98.0%(GC)(T))Phospho-Akt (Ser473) (D9E) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 647 Conjugate)IL-4  白介素4抗體

4-甲基烯酰氧-2,2,6,6-四甲基哌啶1-氧自由基(>98.0%(GC)(T))GEF-H1 (55B6) Rabbit mAbIL-3R alpha/CD123  白介素3受體a鏈抗體
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