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注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測(cè)步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測(cè)試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請(qǐng)勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請(qǐng)臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測(cè)稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測(cè)稀釋液B：1×10ml。
2-己酮(standard for GC,>99.5%(GC))ATGL (30A4) Rabbit mAbalpha,alpha-二酸

正庚(standard for GC,≥98%(GC))Mig6 Antibody1,2-二溴四氟

七氟丁酸(98%)Phospho-eIF4G (Ser1108) Antibody2,6-二溴-

2,5-己二酮(standard for GC,≥99%(GC))Phospho-eIF4G (Ser1108) Antibody二酸單甲酯單鹽

2,5-己二酮(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.5%(GC))HSP27 Antibody (Rodent Preferred)(R)-1-BOC-羥甲基哌

己烷(分析標(biāo)準(zhǔn)品，≥99.8% (GC))PPARγ (81B8) Rabbit mAb5-羥基煙酸

六氟異(HFIP)(用于GC衍生化, ≥99.8% (GC))eIF4H Antibody1,2,4,5-環(huán)己烷四甲酸二酐

甲酸(標(biāo)準(zhǔn)品)VEGF-C Antibody酰氨基環(huán)己酮

糠(standard for GC, ≥99.5% (GC))PDI Antibody咪唑并[1,2-a]嘧啶

鄰二甲酸二正戊酯(CP,97%)AS160 Antibody-甲酸

3',3'',5',5''-四溴酚酞酯(80%,用于顯微鏡)Glu-Glu Tag Antibody-2,8-雙(三氟甲基)喹啉

三(無水級(jí),≥99％,含100-200ppm戊穩(wěn)定劑)PRMT1 (A33) Antibody咪唑并[1,2-a]吡啶

異(無水級(jí), 99.5%)APP/β-Amyloid (NAB228) Mouse mAb氟鄰二甲酸

四(無水級(jí),≥99.9%, 無穩(wěn)定劑)APP/β-Amyloid (NAB228) Mouse mAb2,二氟甲酸

四(ACS,>99.5%(GC))APP Antibody溴-1-甲基-1H-吡唑

正庚烷(AR,98%)PRMT1 (F339) Antibody2,4,5-三氟溴芐

正庚烷(分析標(biāo)準(zhǔn)品,≥99.8%(GC))Neuronal Marker IF Antibody Sampler Kit II1-叔丁氧羰基-哌啶酸

正庚烷(>99%(GC))PathScan® Total Btk Sandwich ELISA Kit溴鄰二

GDP解離抑制因子2(GdI2)ELISA試劑盒MDM2  雙微體2癌基因100 ul

GAD/IA2自身ELISA試劑盒Phospho-MDM2 (Ser166)  酸化雙微體2癌基因100 ul

G1/S特異性細(xì)胞周期蛋白E1(CCNE1)ELISA試劑盒MDR1/p-GP/CD243  多藥耐藥蛋白/P-糖蛋白100 ul

F-肌動(dòng)蛋白(F-actin)ELISA試劑盒MEF2A  肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2100 ul

FOS 樣抗原2(FOSL2)ELISA試劑盒Phospho-MEF2A (Thr312)  酸化肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2500 ul

FMS樣酪氨酸激酶3配體(Flt-3L)ELISA試劑盒Phospho-MEF2A (Ser408)  酸化肌細(xì)胞增強(qiáng)因子2300 ul

FMS樣酪氨酸激酶3(Flt3)ELISA試劑盒Megsin  絲氨酸蛋白酶抑制劑B7100 ul

Fc受體樣蛋白3(FCRL3)ELISA試劑盒Melamine  三聚20 ul

FAM172A蛋白(FAM172A)ELISA試劑盒Melamine  三聚300 ul
微生物致病菌PCR快速系列規(guī)格腺苷三磷酸結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)體9抗體Alstonine中文名：別名：分子式：C21H20N2O3

三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4抗體6-Acetonyl-N-methyl-dihydrodecarine中文名：別名：分子式：C23H215

肌動(dòng)蛋白結(jié)合蛋白LIM3抗體3-Furfuryl 2-pyrrolecarboxylate中文名：別名：分子式：C10H93

高爾基復(fù)合體相關(guān)蛋白1抗體Vincosamide中文名：喜果苷別名：Vincoside lactam分子式：C26H30N2O8

乙酰輔酶A羧化酶1ACCα抗體Corypalmine中文名：紫堇根堿別名：分子式：C20H234