?
注意事項(xiàng)：1．基礎(chǔ)程序；2．?dāng)U增溫度和延伸溫度；3．反應(yīng)時(shí)間；4．循環(huán)次數(shù)；5．PCR 反應(yīng)液的配制；6．PCR技術(shù)的基本原理；7．PCR的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)；8．PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；9．PCR反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）　　　 1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
三、注意事項(xiàng)
１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。
２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。
３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。
４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。
５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。
６．試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。
７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。檢測步驟：
一、 試劑的準(zhǔn)備
從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液(BC-qPCR MIX)、酶混合物(Enzymes MIX)，冰上融化并振蕩混勻后，10000rpm離心10s。
設(shè)所需要的PCR反應(yīng)管管數(shù)為N(N=樣本數(shù)+1管陰性對(duì)照+1管陽性對(duì)照)，每個(gè)測試反應(yīng)體系配制如下表：
試劑 每個(gè)反應(yīng)加入的量 N個(gè)反應(yīng)加入的量
熒光PCR反應(yīng)液 14µL N×14µL
酶混合物 1 µL N×1 µL
總量 15 µL N×15µL
（1） 計(jì)算好各試劑的使用量，加入一適當(dāng)體積潔凈離心管中，充分混勻，10000rpm離心10s，向設(shè)定的N個(gè)PCR反應(yīng)管中分別加入15μL熒光PCR反應(yīng)液，向每管中加入處理后樣品或陰性對(duì)照(NTC)和陽性對(duì)照(BC-PTC)5μL，10000rpm瞬時(shí)離心10秒。
7.2 qPCR反應(yīng)條件
將各反應(yīng)管放入定量PCR儀器的反應(yīng)槽內(nèi)。
推薦循環(huán)條件:
1循環(huán) 50℃ for 2 min
預(yù)變性 1循環(huán) 95℃ for 10 min
PCR擴(kuò)增 40循環(huán) 95℃ for 15 sec
60℃ for 60 sec
在60℃延伸時(shí)收集熒光信號(hào)。報(bào)告基團(tuán)：設(shè)置為FAM。淬滅基團(tuán)：NONE，請勿選擇ROX參比熒光。
組成及試劑配制:
1、酶標(biāo)板：一塊（96孔）
2、 標(biāo)準(zhǔn)品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至0.5ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時(shí)反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為200 U/L，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進(jìn)行倍比稀釋），分別配制成200 U/L，100 U/L，50 U/L，25 U/L，12.5 U/L，6.25 U/L，3.12 U/L，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 U/L。如配制100 U/L標(biāo)準(zhǔn)品：取0.3ml （不要少于0.3ml ）200 U/L的上述標(biāo)準(zhǔn)品加入含有0.3ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
CHAPSO；[(膽固氨基)二甲基氨基]-2-羥基-1-磺酸IRS-1 (D23G12) Rabbit mAb1,12-二氨基十二烷

二硫赤蘚(D)；1,二硫代赤蘚VEGF Receptor 3 (C82A2) Rabbit mAbL-谷氨酸雙芐酯對(duì)甲磺酸鹽

N-硝基-L-精氨酸甲酯YAP/TAZ (D24E4) Rabbit mAb (Biotinylad)1,6-二溴芘

N-甲酰-L-酪氨酸酯(BE)PSD95 (D74D3) XP® Rabbit mAbS-*基-L-半胱氨酸

AEBSF絲氨酸抑制劑PSD95 (D74D3) XP® Rabbit mAb(R)-吡咯烷

AEBSF(進(jìn)分)α-Smooth Muscle Actin (D4K9N) XP® Rabbit mAb (Alexa Fluor® 488 Conjuga)2-氟-5-甲

鹽酸貝他定(進(jìn)口)Drosha (D30F3) Rabbit mAb9-雙環(huán)[3.3.1]壬烷

鄰菲啰啉鹽酸鹽，一水MeCP2 (D4F3) XP® Rabbit mAb (PE Conjuga)1,雙(2,6-二異基)-4,5-二氫咪唑 四氟酸鹽

膦酰二肽鈉eIF3A (D51F4) XP® Rabbit mAb2,4,6-三氟甲酸

癸基喃葡萄糖;癸基吡喃葡萄糖苷eIF3A (D51F4) XP® Rabbit mAb2-氨基二甲酮

德羅特韋(GSK-1349572,DTG)eIF3H (D9C1) XP® Rabbit mAb2-氨基-酚

十二烷基吡喃葡萄糖苷；月桂酰基喃葡萄糖HIF-1β/ARNT (C15A11) Rabbit mAb氨基-酚

羥基纖維素(20000~30000 mpa.s)Acetyl-Histone H2B (Lys20) (D7O9W) Rabbit mAb酸鈉

羥基纖維素(5500-6500 mpa.s)Atg3 Antibody5-氨基-2-溴甲酸

羥基纖維素(40~60 mpa.s)Atg3 Antibody5-氨基-2-甲酸

異基-β-D-硫代半糖苷(IPTG)IKKε (D61F9) XP® Rabbit mAb氨基-甲氧基甲酸

甘露糖；D-甘露糖IKKε (D61F9) XP® Rabbit mAb2-氨基-5-酚

D-甘露糖(標(biāo)準(zhǔn)品)CTCF (D1A7) XP® Rabbit mAb甲

基質(zhì)金屬蛋白酶2/明膠酶A(MMP-2/Gelatinase A)ELISA試劑盒Phospho-Rb (Ser780)  酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白120 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶14(MMP-14)ELISA試劑盒Phospho-Rb (Ser807/Ser811)  酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1300 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶13(MMP-13)ELISA試劑盒Phospho-Rb (Thr821)  酸化視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤相關(guān)蛋白1100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶10(MMP-10)ELISA試劑盒secretory IgA  分泌型免疫球蛋白A100 ul

基質(zhì)金屬蛋白酶1(MMP-1/Collagenase I)ELISA試劑盒RECK  金屬蛋白酶抑制因子RECK100 ul

肌質(zhì)網(wǎng)膜鈣ATP酶(SERCA)ELISA試劑盒REG4/RELP  再生基因蛋白4100 ul

肌酸激酶同工酶MM(CK-MM)ELISA試劑盒RELN/Reelin  絡(luò)絲蛋白100 ul

肌酸激酶同工酶MB(CK-MB)ELISA試劑盒Rbms3  抑癌基因Rbms3100 ul

肌酸激酶同工酶BB(CK-BB)ELISA試劑盒RET/C ret  指狀蛋白R(shí)ET100 ul
豬痢疾密螺旋體PCR檢測試劑盒廠家橋粒芯糖蛋白2抗體Arjulic acid中文名：別名：2α,3β,23-Trihydroxyolean-12-en-28-oic acid分子式：C30H48O5

細(xì)胞間粘附分子非整合素蛋白3抗體22α-Hydroxy-3-oxo-12-ursen-30-oic acid中文名：別名：分子式：C30H46O4

CD299抗體Moronic acid中文名：別名：分子式：C30H46O3

C型凝集素結(jié)構(gòu)域家族4成員A抗體Senegalide中文名：別名：分子式：C26H30O8

DNA損傷結(jié)合蛋白1抗體Swietemahalactone中文名：別名：Senegalension A分子式：C27H30O10